纳米钴铁氧体诱导大鼠肺氧化炎症应激的机制探讨

生活常识 2025年02月09日 08:18 52 admin

　　由于其超顺磁性，钴铁氧体纳米颗粒(CFN)被应用于数据存储、成像、药物管理和催化等领域。CFN的广泛使用大大增加了人们和环境对这些纳米颗粒的暴露。到目前为止，还没有任何发表的论文描述反复口服这种纳米制剂对大鼠肺部的不良影响。因此，本研究旨在阐明不同浓度CFN对大鼠的肺毒性作用，并探讨其毒性作用的机制途径。选用28只大鼠，平均分为4组。对照组给予生理盐水，试验组给予0.05、0.5、5 mg/kg bwt剂量的CFN。我们的研究结果表明，CFN增加了剂量依赖性氧化应激，表现为MDA水平升高和GSH含量下降。组织病理学检查显示，0.5和5mg CFN给药组肺间质性炎症伴支气管和肺泡损伤。所有病变均经免疫组化染色证实，显示强iNOS和Cox-2蛋白表达。TNFα、Cox-2、IL-1β基因表达上调，IL-10、TGF-β基因表达下调。此外，在所有可测量参数中，接受0.05 mg CFN的组没有表现出任何明显的毒性。我们的结论是，每天口服0.5或5mg CFN，而不是0.05 mg，可以通过NPs和/或其浸出成分(钴和铁)介导的氧化炎症应激诱导肺毒性。我们的研究结果可能有助于阐明这些纳米颗粒产生肺毒性的机制，通过概述大鼠作为人类模型的风险评估标准。

　　钴铁氧体纳米颗粒(CNP)因其广泛的治疗和农业应用而受到越来越多的关注[1]。此外，与氧化铁纳米颗粒相比，磁性特性的改善在生物技术的几乎每个领域都很有前景，包括生物传感器、分离和纯化、药物管理、成像和治疗递送系统[2]。CFN是金属磁工程纳米颗粒制剂的主要类别之一[3]。由于其独特的特性和在不同医学、兽医和工程领域的广泛应用前景，越来越多的人开始关注它们的毒性以及它们可能对公共卫生造成的不良影响[4]。

　　尽管纳米材料在各个领域的应用越来越多，但它们对暴露的制造商、行业工人和患者都有不利的影响，因此对未来的医学来说是一把双刃剑[5,6]。由于纳米颗粒具有较高的化学反应活性和生物活性，人们普遍认为纳米颗粒比大颗粒具有更大的毒性[7]。CFN主要通过吸入和摄入等多种途径进入人体[8]，并通过细胞膜与亚细胞元件相互作用，导致细胞膜破坏和细胞死亡[9]。一些体外研究揭示了CFN的细胞毒性作用[10,11]，但CFN的毒性作用在不同的实验动物模型中表现出不同的结果，缺乏潜在的机制，特别是从病理和分子的角度来看[12,13,14]。生物系统中影响CFN毒性的因素包括包衣材料、大小、浓度、给药途径、暴露频率和动物模型等[15]。CFN有可能穿过组织屏障，通过血液进入其他器官，特别是肺、脾、肝和肾，引起氧化应激损伤和炎症反应[16]。近期研究证实，短期吸入CFN可引起豚鼠呼吸毒性[17]。由于肺泡表面积大且空气-血液相互作用密切，因此肺泡不能很好地屏蔽NPs[18]。因此，肺是NPs的主要作用靶点，即使是口服或通过其他途径吸入，肺部NPs毒性是最值得注意和关注的影响之一[19]。给妊娠白化大鼠注射CFN后，CFN穿过血胎盘屏障，沉积在胎儿器官内，引起氧化损伤[13]。CFN的毒性可能与颗粒本身或其泄漏离子(钴和铁)导致活性氧(ROS)过度生成导致脂质过氧化、蛋白质降解、DNA损伤导致细胞死亡有关[20]。

　　纳米颗粒对生物系统的影响和呼吸风险的可能性取决于它们的各种特征，包括大小、形状、表面电荷、化学性质、溶解度和团聚程度[21]。最近关于NPs可能的职业和环境影响的研究表明，多灶性肉芽肿、支气管周围炎症、进行性间质纤维化、持续性炎症反应、胶原沉积和氧化应激是NPs暴露的一些不利呼吸后果[22]。针对这一领域的研究，无论是以整体组合形式还是以单个金属基NPs碎片的形式进行调查研究，都是当前的需要。当前研究的主要目标是强调和弄清楚CFN和/或其浸出成分(Co和Fe)的潜在和实际的呼吸毒性作用，CFN和/或其浸出成分(Co和Fe)是最突出的金属基工程磁性纳米颗粒之一，具有明确和明显的研究问题和空白，应该被覆盖和回答。

　　CFN是根据Varma等[23]采用一步燃烧法合成的，并进行了一定的修改。它涉及所有以硝酸盐形式存在的金属前体与柠檬酸的等摩尔比之间的反应。将2摩尔硝酸铁(Fe (NO3)3·9H2O, Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)加入1摩尔硝酸钴(Co (NO3)2·6H2O, Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)，然后在磁力搅拌器上完全溶解。在另一个烧杯中，将柠檬酸溶解在蒸馏水中，并滴加到硝酸金属前体溶液中。然后用氨水滴液调整pH值，直至达到中性。这种粘性凝胶是沸腾后形成的。在这一点上，最大的能量将释放从化学反应后糊化。所得粉末呈泡沫状，蓬松，颜色为黑灰色。收集的粉末然后在120°C中干燥，以确保温度均匀。将纳米颗粒用玛瑙砂浆研磨成非常细的粉末，并过筛至均匀。

　　采用x射线衍射仪(解析-x′pertpro, Cukα1辐射，λ=1.5404 ?， 45 kV, 40 mA，荷兰)对样品进行了相形成和结晶相分析。结果采集于2- θ范围20°≤2θ≤70°，步长为0.02°，辐照时间为0.5 s/步长。此外，采用Scherrer方程计算粒径[24]。傅里叶变换红外(FTIR)研究是为了确保相纯度和使用FTIR在CFN中形成的化学键的性质(Thermo Fisher Scientific Inc.， Pittsburgh, PA, USA)。此外，利用Nano-Zetasizer 3000 HS (Malvern Instruments, Malvern, UK)测量了动态光散射(DLS)测量的平均水动力粒径，以及与颗粒表面电荷大小和分散在水中的大型聚合物物质的分子量相关的CFN的zeta电位。采用德国卡尔蔡司公司的Zeiss Sigma 500VP分析型FE-SEM对粉末样品进行场发射扫描电镜成像，加速电压高达30kV。

　　开罗大学机构动物护理和使用委员会根据欧洲理事会指令(EU2010/63)的要求批准了实验方案。研究对象为28只平均体重150 ~ 170 g的雄性Wistar大鼠。它们是从埃及开罗大学兽医学院实验动物部门购买的。它们被饲养在覆盖木屑的聚合物笼中，并保持在22°C, 55%的相对湿度，每天12小时的光照循环。实验期间给大鼠喂干的商业标准颗粒(Al-Watania food Co.， Giza, Egypt)，并给它们无限制的自来水。试验前对大鼠进行2周的习惯饲养。

　　将大鼠随机分为4组(n=7)， 14 d内口服给药，每天1 mL。阴性对照组(1组)仅给予生理盐水，2、3、4组依次给予0.05、0.5、5 mg/kg BWT剂量的CFN。虽然在大鼠中没有CFN的参考剂量，但最近的一项研究描述了该纳米制剂在小鼠体内的毒性[25]。因此，我们以本研究为参考，采用不同实验动物种间的剂量换算公式(https://dosecal.cftri.res.in/index.php)选择NPs的高剂量(5mg)。此外，我们还选择了低剂量(0.5和0.05 mg)来探索CFN在医学上的安全剂量水平。

　　给药后14天，取各组大鼠肺。其中一部分保存在?80°C，用于分子和生化分析，其余部分固定在10%中性缓冲福尔马林中进行组织病理学和免疫组织化学检查。

　　使用市售比色试剂盒(Biodiagnostic, Cairo, Egypt)的说明，估计每组肺组织中丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的水平。

　　为了制作石蜡包埋组织切片，将福尔马林固定的肺组织样品用分级乙醇排干，二甲苯清洗，石蜡浸渍，在4.5 μm处切片。然后用H&E染色，在奥林巴斯BX43光学显微镜下观察其组织学组织。之后，我们使用连接到CellSens尺寸软件的奥林巴斯DP27相机拍摄照片(产品版本，1.13;核心版本，XV 3.12 (Build 13479)) (https://www.olympus-lifescience.com/en/software/cellsens/)[26]。

　　染色玻片作为盲法提供给兽医病理学家(1,2,3，…)，并对每个病理参数进行半定量评分和分配(1 - 5)。我们对血管损伤、支气管和细支气管损伤、肺泡损伤、气道炎症、气道水肿、出血和间质炎症的严重程度和分布进行了分级:(1)组织学正常，(2)轻度< 10%的组织损伤(TD)，(3)轻度11-25%的TD，(4)中度26-50%的TD，(5)重度> 50%的TD[27]。

　　采用免疫组化方法鉴定肺切片中iNOS和Cox-2为炎症指标。简单地说，两种一抗(Abcam Ltd.， USA)在与ABC反应所需的试剂(Vectastain ABC- hrp Kit, Vector Laboratories)一起孵育前，先与去蜡化的组织切片一起孵育。之后，切片用过氧化物酶和dab显色底物(Sigma)标记，然后在奥林巴斯光学显微镜下检查。采用Image J软件，通过计算每组每切片(共7个切片)3个切片的百分比面积(总像素/场数)来测定两种免疫标记物的表达。

　　使用RNeasy迷你提取试剂盒，按照制造商的建议(Qiagen)从组织样本中分离总RNA。在使用DNase I去除DNA污染(立陶宛Fermentas)后，按照制造商的说明使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)生产互补DNA (cDNA)。使用genbank中找到的褐家鼠序列创建用于评估特定基因mRNA水平的引物集(表1)。引物使用primer3软件创建。采用SYBR Green PCR Master Mix (Thermo scientific Cat编号:4309155)进行实时荧光定量PCR分析，评估所选基因的相对表达。使用应用生物系统公司的ABI Prism SteponePlus Real-Time PCR系统[28]，根据制造商的说明，对每个样品进行两次PCR反应。管家基因β -肌动蛋白的表达水平被用来调节白细胞介素-1β (IL-1β)、白细胞介素-10 (IL-10)、转化生长因子-1β (TGF1β)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的表达水平。采用DDCt技术分析基因表达数据[29]。

　　表1特异基因引物集

　　采用火焰原子吸收光谱法(AAS 5 FL, Carl Zeiss Jena GmbH，德国)测定钴(Co)和铁(Fe)的含量，方法由Hassanen等人描述[30]。

　　氧化应激和基因表达等参数数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，采用SPSS 25版进行事后邓肯检验;P值小于0.05为差异有统计学意义。数据用平均数和平均数的标准偏差(mean±SD)来描述。包括组织学病变等级在内的非参数数据以中位数表示，采用Kruskal-Wallis H检验和Mann-Whitney U检验进行分析。

　　摘要。

　　介绍

　　材料与方法

　　结果

　　讨论

　　结论

　　参考文献。

　　数据和材料的可用性

　　作者信息

　　道德声明

　　# # # # #

　　图1a为未进一步热处理的制备粉末样品的x射线衍射(XRD)图。使用JCPDS文件COD1540973很容易对数据进行索引。所有的峰都很宽，强度小，这是纳米级晶体的指纹。尽管纳米颗粒的尺寸很小，但它们的结晶度相当优异。峰表示Co铁氧体在六方相中形成，空间群为R3-m。根据Scherrer公式计算纳米颗粒的晶粒尺寸为30 nm。FTIR图(图1b)显示了铁氧体纳米颗粒的形成，并在XRD中保证了所获得的相。470和418 cm?1处的透射率指向纳米颗粒中的金属氧键(Co-O)，而555 cm?1处出现的透射率归因于Fe-O键[31]。从图1c所示的DLS数据来看，水动力直径在48.4 nm左右达到峰值，多分散性指数PDI=1。此外，图1d显示了所研究的磁性纳米颗粒的zeta电位的测量值。数据显示20 mV的正值，这意味着粒子具有正的表面电荷。另外，由于该方法在溶液中的稳定性较高，所以该数值较大，适用于该方法。所制备的纳米颗粒的形貌成像并表示在图1e中。扫描电镜照片显示大颗粒岩石状形态。描述了许多类型和不同形状的孔隙，确保了细粉末的多孔性。所研究的纳米颗粒由于其大的表面积和不同大小的封闭孔，将是有希望的候选者。

　　图1

　　CFN的表征，(a) x射线衍射图，(b) FTIR图，(c)粒径分布曲线，(d) CFN的zeta电位，(e)场发射扫描电镜图像说明了制备的纳米颗粒的形貌

　　与对照组相比，最高剂量组肺组织GSH含量显著降低，MDA含量显著升高。此外，与对照组相比，暴露于低剂量和中剂量的CFN(0.05和0.5)导致GSH和MDA水平无显著变化(图2)。

　　图2

　　不同剂量的CFN对肺部氧化/抗氧化生物标志物水平的影响。(a)丙二醛水平和(b)谷胱甘肽活性。数值以mean±SD表示(n=7只大鼠/组)。* p < 0.05

　　对照组肺组织支气管、细支气管、肺泡、间质组织学结构正常(图3a)。同样，接受0.05 mg磁性NPs的组除了肺泡毛细血管充血和轻度间隔增厚外，显微镜下外观正常(图3b)。另一方面，0.5 mg磁性NPs组出现中度间质性肺炎。间质组织可见多灶性淋巴浆细胞浸润，伴有弥漫性间隔增厚(图3c)。一些支气管和细支气管上皮内层出现中度脱屑，腔内单核炎性细胞聚集(图3d)。大多数肺动脉和小动脉呈同心层状肌肉增生(图3e)。5 mg NPs组出现严重间质性肺炎，伴弥漫性肺泡损伤(图3f)。大多数血管表现为血管炎并伴血管周围淋巴细胞割伤(图3g)。大多数支气管和细支气管上皮细胞上皮坏死，伴有腔内炎症细胞聚集(图3h)。

　　图3

　　H&E染色肺切片显微镜图像显示不同治疗组:(a)对照组显微镜外观正常，(b) 0.05 mg CFN组表现为轻度间隔增厚，(c-e) 0.5 mg CFN组和(f-h) 5 mg CFN组表现为严重的组织病理学改变。注:炎性细胞浸润(黑星)、血管炎(红箭头)、出血(红星)、水肿(蓝三角形)、同心层状肌肉增生(蓝三角形)、支气管和细支气管上皮坏死(黑箭头)

　　各NPs治疗组病理组织学评分均较对照组明显升高，但各参数评分均以5mg NPs治疗组最高(表2)。

　　表2各实验组显微病变评分

　　对照组肺切片iNOS和Cox-2蛋白表达均为阴性。此外，所有给予NPs的组均表现出两种免疫标记物的剂量依赖性增加。免疫组化反应以5mg NPs组最高，其次为0.5 mg NPs组，0.05 mg NPs组免疫反应为阴性至弱阳性(图4)。

　　图4

　　不同治疗组iNOS和Cox-2免疫染色表达的显微图像。(a、b)阴性免疫表达对照组，(c、d) 0.05 mg CFN轻度免疫表达组，(e、f) 0.5 mg CFN组，(g、h) 5 mg CFN组，两种免疫标记物均呈强阳性

　　测定不同实验组肺组织m-RNA促炎基因(TNF-α、IL-1β)及抗炎基因(IL-10、TGF-1β)的表达水平。TNF-α和IL-1β转录物水平在NPs中、高剂量组均有显著上调。另一方面，中、高剂量组IL-10和TGF-1β转录物水平均出现下调。此外，低剂量组上述基因的转录水平与对照组相比无显著差异(图5)。

　　图5